EcoRI限制性内切酶

产品货号：

RFT901

中文名称：

EcoRI限制性内切酶

英文名称：

EcoRI

产品规格：

500μL

发货周期：

1～3天

产品价格：

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本酶是经过基因工程重组，能够在5～15分钟之内快速剪切DNA的快速酶。所有RealQuick系列限制酶都适用于通用的反应缓冲液，可以在同一个反应体系内任意组合，无需多次单酶切或更换酶切缓冲液。该系列限制性内切酶均经过多个严格的质控环节，适用于质粒DNA、PCR产物或基因组DNA等的快速酶切。

识别位点

5'…G^▼A A T T C…3'
3'…C T T A A_▲G…5'

产品组成

组份	规格
RealQuick EcoRI	500μL
10×RealQuick buffer	2×1mL
10×RealQuick Color buffer	2×1mL

37℃下，在20μL反应体系中，1μL酶能够在15分钟内完全消化1μg λ DNA。

酶热失活

80℃加热20分钟。

质量控制

超长时间温育/星号活性(Star Activity)检测：
将1μL RealQuick EcoRI与1μg λ DNA共温育1小时后，并未检测到由于其他核酸酶污染或星号活性而引起的底物非特异性降解。但更长时间的温育有可能出现星号活性。
酶切-连接-再酶切检测：
使用10倍酶量消化底物，回收酶切产物。在22℃下使用适量T4 DNA连接酶可以将超过95%的酶切产物重新连接。将连接产物再次回收后，使用相同的内切酶可以重新切开超过95%的连接产物。
外切酶活性检测：
在50μL反应体系中，使用10倍酶量与1μg超声波断裂的³H标记DNA (105 cpm/μg)片段在37℃下温育4小时后，释放出<0.1%的放射性。
非特异性内切酶活性检测：
使用10倍酶量与1μg超螺旋质粒DNA共同温育4小时后，使用琼脂糖凝胶电泳检测，质粒DNA仍然处于超螺旋状态。
蓝白斑检测：
将含有单一lacZα基因的载体以10倍酶量消化，重新连接后转化入大肠杆菌感受态细胞，涂布在含有对应抗生素、IPTG和X-gal的LB培养基平板上。连接正确的产物会生长出蓝色菌落，而连接错误（即DNA末端切口不完整）的产物将得到白色菌落。对于RealQuick系列限制酶而言，白色菌落比例应小于1%。

一、DNA快速酶切流程

在冰上按如下建议的加样顺序配制反应体系：

加入顺序	组份	质粒DNA	PCR产物	基因组DNA
1	去离子水	15μL	16μL	30μL
2	10×RealQuick buffer	2μL	3μL*	5μL
3	底物DNA	2μL（up to 1μg）	10μL（~0.2μg）	10μL（5μg）
4	RealQuick EcoRI	1μL	1μL	5μL
	总体积	20μL	30μL	50μL

*本体系适用于经过纯化的PCR产物酶切。未纯化的PCR产物具备一定的离子强度，10×RealQuick buffer加入量可适当减少至2μL。但由于DNA聚合酶同时具有外切酶活性，会影响酶切产物，因此如下一步需进行克隆等操作，建议酶切前对PCR产物进行纯化。

轻柔吸打或轻弹管壁以混匀（切勿涡旋），然后瞬时离心以收集挂壁液滴；
37℃温育15分钟（质粒），或15～30分钟(PCR产物），或30～60分钟（基因组DNA）；
80℃加热20分钟即可使酶失活，停止反应（可选）。

二、双酶切或多酶切

每种酶的用量为1μL，并根据需要适当扩大反应体系。
所有酶的体积总和不得超过总反应体系的1/10。
如果所用的限制酶要求的最适反应温度不同，应先以最适温度较低的酶开始酶切，再添加最适温度较高的酶，以较高的温度进行温育。

三、适用于质粒的扩大反应体系

质粒DNA	1μg	2μg	3μg	4μg	5μg
10×RealQuick buffer	2μL	2μL	3μL	4μL	5μL
RealQuick EcoRI	1μL	2μL	3μL	4μL	5μL
总体积	20μL	20μL	30μL	40μL	50μL

四、甲基化修饰影响

Dam	Dcm	CpG	EcoKI	EcoBI
无影响	无影响	序列重叠时剪切可能受影响	无影响	序列重叠时剪切可能受影响

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